行研｜生物医用材料（四）胶原蛋白—蓬勃发展的天然材料（上）

Evelyn
2021-04-21
目录
天然生物医用高分子材料概述
丝素蛋白新型材料研究报告
透明质酸行研报告
壳聚糖材料研究报告
胶原蛋白研究报告





胶原蛋白(Collagen)，或称胶原，是一种生物高分子材料，是细胞外基质的重要组成部分，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的30%左右，广泛存在于猪、牛、羊等哺乳动物的皮、骨骼、软骨、肌腱、角膜、血管等结缔组织，以及鱼皮、鱼鱗、鱼骨等水产动物组织中。胶原具有良好的生物相容性、低免疫原性和组织可降解吸收性，在创面止血、愈合，缺损组织的填充、修复及重建、药物载体和组织工程等方面有广泛应用，是理想的医用生物材料。本文对胶原蛋白结构、生物学特性、改性研究及其在医用生物材料方面的应用进行了介绍，旨在为胶原蛋白临床应用研究提供参考。


一、胶原蛋白概况
胶原的研究历史可追溯到1940年，文献报道称，采用柠檬酸缓冲液(pH=3-4.5)可从大鼠皮肤中溶解出一种不溶于水的蛋白质。通过80年的研究，现已肯定胶原并不是具体某种蛋白质的专有名词，而是既具有共同特征又存在结构差异性的一组蛋白质的统称。到目前为止，在脊椎动物体内已发现有28种蛋白质可归属于胶原的范畴，它们按照被发现的先后顺序依次用大写罗马数字进行编号，分别称为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原……XXVIII型胶原。然而现在对胶原仍没有十分权威的定义，一般认为，如果一种蛋白质能够称为胶原，那么它应同时具有以下三个特点:①包含至少一个三股螺旋( triple helix)结构域；②能够形成超分子聚集体;③存在于细胞外基质中。


按照胶原是否能成纤维进行分类，可将所有胶原分为成纤维胶原( fibril-rorming cllagen)和非成纤维胶原(non- fibril- forming collagen)两大类，其中成纤维胶原包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、XXIV和XXVII型胶原。其中，I型胶原是最普遍存在的胶原，占体内胶原总量的80%-90%左右。非成纤维胶原又分为:①纤维相关胶原；②网状结构胶原；③珠状细丝胶原；④锚定胶原；⑤跨膜胶原；⑥内皮抑素相关胶原；⑦XXVI型胶；⑧XXVIII型胶原。

图表1 成纤维蛋白分布情况


胶原的三螺旋结构特征
所有的28种不同的胶原都具有一个共同的结构元素，即三股螺旋结构。胶原的三股螺旋结构是由3条α链相互缠绕成草绳状而形成的右手超螺旋结构；每条α链自身为较伸展的左右螺旋构象，每圈含3.33个氨基酸。胶原的三股螺旋结构是由胶原的一级结构，即胶原α链氨基酸的组成和排列方式所决定的，构成三股螺旋结构的三条α链可以完全相同，也可以两条相同而与另外一条不同，也可以三条彼此都不相同。由于三螺旋构象的特性，使得胶原分子具有强烈的自组装能力，可以形成多层次液晶结构、纤维结构以及织态结构等。

图表2  胶原的三螺旋结构

来源：《胶原化学》


1.胶原的结构
（1）一级结构
一级结构是蛋白质分子中氨基酸以肽键连接的顺序，每一种蛋白质分子，都有其特定的氨基酸组成和排列方式，由此也就决定了不同的空间结构和功能。蛋白质分子中一级结构关键部位氨基酸的改变，会直接影响其功能，这个关键部位就是蛋白质分子的活性中心。胶原的氨基酸组成有如下特征:


在大多数蛋白质的同一条多肽链中，氨基酸一般不会有周期性的重复顺序，但胶原的胶原域却有甘氨酰-脯氨酰一脯氨酰、甘氨酰-脯氨酰-Y和甘氨酰-X-Y(X、Y代表除甘氨酰和脯氨酰以外的其他任何氨基酸残基)这样一些三肽的重复顺序存在，甘氨酸几乎占总氨基酸残基的1/3，即每隔两个其他氨基酸残基(用X和Y表示)即有一个甘氨酸，故其肽链可用(Gly-X-Y)n来表示。X位置常由脯氨酸残基占据(约20％～30％)。甘氨酰-脯氨酰-Y三肽的数量为全部三肽总和的将近1/3。


这种三肽重复顺序对胶原的结构起着很大的作用。例如Ⅰ～Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型胶原属于成纤维胶原，它们分子中的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成，而其他非纤维胶原的胶原域中的三股螺旋是不连续的，至少存在一个中断处。这个中断处就在三肽重复顺序中，即不是甘氨酸-X-Y，而是甘氨酸-X-甘氨酸-X-Y或甘氨酸-X-Y-X-Y。


胶原蛋白含有较多在其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基，也有较多脯氨酸和赖氨酸。如脯氨酸(Pro)和4-羟脯氨酸(4- hydroxyproline，Hyp)含量高达15％～30％。同时还含有少量3-羟脯氨酸(3- hydroxyproline)和5-羟赖氨酸(5- hydroxylysine，Hyl)。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原分子。例如，正常胶原在39℃变性，而在缺乏脯氨酸羟化酶条件下合成的胶原在24℃即可变性成为白明胶。


（2）二级结构
蛋白质的二级结构是指其多肽链主链骨架中的若干肽段所形成的有规则的空间排布(α-螺旋、β折叠、β转角)或无规则的空间排布(如无规则卷曲)。如前文所述，胶原蛋白的二级结构是由3条肽链组成的三螺旋结构。在这种超螺旋体中的每一股又是一种特殊的左手螺旋体，它与α螺旋体不同，超螺旋体中各条链借助甘氨酸残基的肽键之间形成的氢键交联在一起。


胶原蛋白的基本结构单位是原胶原蛋白分子，相对分子质量约30万，这些基本结构单位头尾相连，并排成束，形成胶原纤维。胶原蛋白的二级结构直接关系到它在体内执行的功能。


（3）三级结构
三级结构则描述了整个肽链，包括主、侧链在内的空间排布。胶原的三级结构是由3条螺旋链拧成的一股绳状的右手螺旋。三级结构主要揭示蛋白质分子中肽链之间的次级键的作用，也就是氨基酸残基侧链的极性基团产生的离子键、氢键和范德华力和非极性基团产生的疏水键、范德华力等作用，使三级结构得以保持稳定。除了这些次级键外，胶原分子内和分子间还有3种交联形式:醇醛缩合交联、醛胺缩合交联、醛醇组氨酸交联。这3种交联把胶原的2条肽链、3条肽链牢固地连起来，使胶原具有很强的抗张强度。


（4）四级结构
四级结构是指分子更大的蛋白质，常由多条肽链组成，分子中每条肽链都盘曲成特定的三级结构，单独存在时并无功能，被称为亚基(subunit)，亚基间再按特定的方式接触排列形成更高层次的立体蛋白质分子。亚基可呈环状、正四面体或正八面体等排列，形成完整的四级结构。组成四级结构蛋白质的亚基数多为偶数，以2～4个亚基组成为多，其种类可相同或不同，又以2种不同亚基居多。


原胶原按规则平行排列成束，首尾错位1/4，通过共价键搭接交联，形成稳定的胶原微纤维，并进一步聚集成束，形成胶原纤维。胶原分子通过分子内或分子间的作用力成为不溶性的纤维，故胶原属于不溶性硬蛋白。因胶原分子氨基酸组成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋白那样以二硫键相连，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联，一般发生在胶原分子的C(羧基)末端或N(氨基)末端之间。


图表3 胶原纤维结构
来源：《胶原与胶原蛋白》

胶原纤维在不同组织中的排列方式与其功能相关。如在肌腱、皮肤及软骨中，要分别在一维、二维和三维方向承受张力，因而其胶原纤维排列分别为平行束状、多角的纤维片层及不规则排列等方式。

图表4 胶原纤维在不同组织中的排列
来源：《胶原与胶原蛋白》

2.胶原的性质
（1）胶原的物理化学性质
①两性电解质性质
胶原是一种两性电解质，等电点是胶原的一个重要物理参数，它与胶原侧链的酸性碱性氨基酸残基的数量和分布方式有关。当在某一pH时，胶原所带正负电荷恰好相等(净电荷为零)，此时的pH即为胶原的等电点。与其他蛋白质一样，处于等电点的胶原具有一些特殊的理化性质，如其导电率、渗透压、黏度以及溶解度等数值均达到最低值。


②胶原侧链基团的反应活性
胶原分子中的碱性氨基酸(如赖氨酸、组氨酸等)含有ε-氨基、亚氨基等活性基团，它们能与许多化学试剂发生反应。此外，胶原肽链中的酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)提供了较多的侧链羧基，其反应活性也很强，能够与很多化合物反应。


③胶原与酸、碱、盐的作用
胶原对酸、碱有一定的缓冲能力，胶原α链上的酸性基团和碱性基团可分别与碱和酸结合，胶原的碱容量约为其酸容量的2倍。过量的酸或碱能够破坏胶原分子内和分子间的氢键和离子键，此时胶原就会因充水而膨胀:在pH低于胶原等电点的溶液中，胶原带正电荷，则充水呈酸膨胀;而在pH高于胶原等电点的溶液中，胶原带负电荷，则充水呈碱膨胀。溶液pH离胶原的等电点越远，胶原就充水膨胀越大。盐对胶原的作用差别很大，有的能使胶原脱水沉淀，此类盐大都能增强胶原三股螺旋构象的稳定性;有的则引起胶原充水膨胀，此类盐大都会破坏胶原构象的稳定性。


④胶原与金属离子的作用
胶原分子中的氨基、亚氨基、羧基、羟基、胍基等活性基团在一定条件下能够与金属离子发生配位反应，生成胶原一金属配位化合物，这就是在制革中采用铬盐、铝盐等无机鞣剂的鞣制化学原理。


（2）胶原的生物学性质
胶原之所以能够广泛用于生物医药、美容护肤等领域，是基于胶原的一些优良的生物学性质，如低抗原性、凝血作用、易被人体吸收以及有利于细胞的存活和生长等性能。


①低抗原性
胶原的抗原性与其他蛋白质相比要低得多，而且胶原常被认为是没有抗原性的蛋白质，但不同制备方法得到的胶原所表现出的抗原性不同。由于胃蛋白酶能去除胶原分子的端肽，而胶原的抗原性主要体现在端肽上，因此采用胃蛋白酶法制备的胶原的抗原性最低。


②凝血作用
血管内皮细胞下层由一系列的细胞外基质蛋白组成，其中的纤维胶原则是诱导血栓形成的主要基质蛋白。当血管壁的内皮细胞被剥离，致使胶原暴露于血液中，流动的血液中的血小板立刻与胶原纤维吸附在一起，发生凝集反应，从而形成血栓。


③促进细胞存活和生长的性能
胶原是生物体细胞外基质的主要成分，将胶原作为细胞培养的基质，通过细胞培养实验可了解不同细胞与各种胶原之间的作用效果。在20世纪50年代，就已发现细胞在胶原上比在玻璃表面上的增殖速度要快。后来又开展了许多相关研究，包括细胞的贴壁附着性、形态、迁移及分裂作用等，特别是近年来关于胶原对细胞的趋化作用也逐渐被人们所认识，如胶原对成纤维细胞的诱导作用能促进创伤治愈。


胶原不仅能促进细胞的分裂增殖，而且对维持细胞的分裂机能也有效果。如角膜上皮细胞分别在微孔膜和胶原膜上培养后，发现在胶原膜上有角膜固有物质生成，而微孔膜上没有该物质出现，因此胶原具有促进角膜上皮细胞分化的作用。


④可吸收性
胶原作为体内移植材料使用时，其被人体吸收的速度是胶原材料的重要性能参数。胶原的三股螺旋结构十分稳定，不能直接被普通蛋白酶水解，而只有胶原酶才能对胶原的体内降解起关键作用。胶原酶能够作用于胶原分子的特定位点，对于I型胶原而言，胶原分子在距离其N末端3/4的位置被切断，此后切断的碎片可进一步被其他蛋白酶水解。


胶原在生物体内发生分解代谢时，因场所不同而分为细胞外和细胞内两种途径。细胞外代谢途径是指在细胞外，胶原纤维经胶原酶、弹性蛋白酶等中性蛋白酶作用，先分解成小分子多肽和氨基酸，再进人血液循环的过程。而细胞内代谢途径为胶原分子先经酶作用被打断成适当分子质量大小的片断后被细胞吞噬，在细胞内进一步被分解成小分子多肽和氨基酸的过程。


二、胶原的制备与改性
1.胶原蛋白的制备
由于胶原是细胞外间质成分，在体内以不溶性大分子结构存在，并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起，因此胶原的制备包括组织材料的选择、预处理、胶原的提取、不同类型胶原的分离和纯化。


胶原蛋白来源广泛，主要存在于动物的肌腱、骨、皮肤、韧带等组织中。目前应用较广的还是以天然获取的胶原为主，一般从牛、猪、鼠、鱼类等动物的肌腱、真皮和尾巴中提取。


胶原蛋白的提取方法有酸法、碱法、盐法、酶法等。碱法提取易导致胶原蛋白变性且会发生消旋反应，一般医用胶原蛋白不采用此法。因组织材料中可溶性胶原蛋白含量较少，提取率不高，盐法提取也较少使用。有研究发现碱法和盐法提取的胶原蛋白三级结构被破坏，没有完整的三螺旋结构。目前，采用酸法和酶法结合提取胶原蛋白的应用较多。酸性溶剂如乙酸等，可使组织溶胀，打开其交联键，利于胶原蛋白的提取；同时，酶制剂如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有专一性，可切断胶原分子N及C端的非胶原性肽，而不改变三螺旋结构。


虽然天然来源的胶原蛋白应用广泛，但其难以修饰，并可能产生致病和免疫不良反应及其批次间的差异性问题，人工重组合成胶原蛋白成为一种新的途径。重组类人胶原蛋白是采用生物基因工程技术将胶原蛋白的基因片段，借助工具酶拼接到适合的载体然后转移到宿主细胞中诱导表达得到，具有质量可控、加工性强、水溶性好、周期性短、较低排斥反应等优点，随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原已取得巨大成果，许多重组表达系统被应用于( 类) 人胶原蛋白的重组表达，如大肠杆菌、酵母、动物细胞、转基因动物和转基因植物等。


大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其遗传背景清楚，发酵成本低、生产周期短、效率高，可以快速大规模生产外源蛋白，具备规模化生产外源蛋白的潜力。同时，有研究认为，采用大肠杆菌表达获得的重组胶原蛋白存在纯化困难的问题及内毒素含量高的风险。


利用酵母表达(类)人胶原蛋白的研究较多，如毕赤酵母、汉逊酵母和酿酒酵母等。毕赤酵母作为一种真核表达系统具有目的蛋白表达量高、纯化方法简单、不受内毒素影响等特点，已广泛应用于重组蛋白的表达。

图表5 不同表达系统表达胶原蛋白研究结果汇总

重组蛋白的分离纯化是发酵产品规模化生产的限制因素，纯化费用约占生产成本的20% ～30% ，甚至更高。目前，重组( 类) 胶原蛋白的分离纯化方法主要有: 亲和层析法、盐析沉淀法、离子交换层析法和凝胶过滤层析结合法等。

此外，人工化学合成胶原蛋白也是一种来源。Kumar等采用36个氨基酸残基胶原模拟多肽自组装设计，形成具有三螺旋结构的纳米胶原纤维，研究发现这种人工合成仿生胶原纤维可以黏附和激活血小板，形成凝块，促进愈合，不引起炎症反应，具有作为止血剂的潜力。


2.胶原蛋白优化与改性
提取、分离和纯化后得到的天然胶原作为一种生物材料已被广泛应用于组织工程、生物医药、整形和美容护肤等领域。然而，天然胶原存在热稳定性较低，成膜能力不强，遇水易溶胀，在体内易被酶降解，还可导致组织钙化等问题，同时，在提取过程中，胶原蛋白原有的天然交联结构会受到不同程度的破坏，缺乏足够的机械强度。因此，此天然胶原往往不能直接应用，通常需要在胶原分子中引入外在交联或其他材料，以保证胶原材料具有一定的机械强度和保持对蛋白酶的“惰性”。


（1）交联改性
交联可影响生物材料的力学性能、吸收动力学和生物相容性与降解性。常用的交联方法有物理交联和化学交联。物理交联包括紫外光照射、热交联、光敏剂氧化交联等方法。物理交联虽然可以避免引入外源物质，但是难以获得理想均一的交联强度，一般只起辅助作用。


图表6  热交联对胶原机械性能的影响

图表7  物理交联对胶原纤维耐蛋白酶水解的影响
化学交联剂主要有戊二醛、京尼平、碳化二亚胺等。戊二醛是使用较早的一种醛类交联剂，能在较低浓度下与胶原交联，改善其亲水性和力学性能。研究表明，戊二醛交联可提高胶原蛋白支架机械强度而不降低其孔径或孔隙率。京尼平是从栀子果实中提取的化合物，具有羟基、酯键等多种活性基团，可直接与氨基酸或蛋白质反应，能较好地维持胶原支架的基本结构，同时提高其生物稳定性；交联后的支架能促进脂肪干细胞增殖并分化成髓核样细胞。碳化二亚胺属于酰胺型交联剂，可促进胶原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基与氨基连接形成酰胺键。


（2）共混改性
引入其他生物材料，与胶原蛋白制成复合材料，是改进胶原蛋白力学性能的有效途径之一，常用的共混材料有羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃、壳聚糖等。


羟基磷灰石是骨骼的主要无机组成成分，对骨质增生有刺激或诱导作用，能促进缺损组织的修复。β-磷酸三钙具有较好的生物相容性和生物活性，植入体内可逐渐降解，是理想的硬组织修复和替代材料。研究发现，将β-磷酸三钙粉末引入多孔胶原基质中，有效改善了胶原支架的力学和生物学性能，能有效激活骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，促进血管化，并与周围组织结合良好。生物玻璃是由SiO2、Na2O、CaO和P2O5组成的硅酸盐玻璃，具有骨生成性和骨引导作用，与骨和软组织都有良好的结合性。壳聚糖是天然高分子物质，其生物相容性良好，具有抑菌、止血等功能。在胶原蛋白支架中添加壳聚糖，改善了支架的机械性能，提高了抗压强度、溶胀率，降低了降解率。



参考资料：

1.《胶原与胶原蛋白》，蒋挺大著，化学工业出版社，2006年

2.《胶原蛋白与临床医学》，顾其胜、蒋丽霞著，第二军医大出版社，2003年

3.《胶原化学》，李国英、刘文涛著，中国轻工业出版社，2013年

4.《胶原蛋白作为医用生物材料对缺损组织修复、再生及重建的作用与意义》，胡康、张伟，中国组织工程研究，2019，23(2):317-322

5.《胶原蛋白改性方法与应用》，张亚飞、逄欣雨等，渔业研究，2020，42( 2) : 185-194

6.《胶原蛋白在整形美容中的研究进展》，张浩玮、胡竟一、 王岚，科技视界

7.《脱细胞猪角膜基质作为植片的深板层角膜移植治疗感染性角膜溃疡的临床观察》，李上、卢红双等，眼科，2018年第27卷第3期

8.《重视人工生物角膜移植手术的适应证选择及围手术期处理》，张明昌、谢华桃，中华眼科杂志，2018年12月第54卷12期


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