行研｜生物医用材料（三）壳聚糖—来源广泛的止血抑菌材料

Evelyn
2021-04-20

目录

天然生物医用高分子材料概述

丝素蛋白新型材料研究报告

透明质酸行研报告

壳聚糖材料研究报告

胶原蛋白研究报告




壳聚糖（chitosan，CS），又称几丁糖，是一种天然大分子化合物，属于多糖结构。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，也是甲壳素最重要的衍生物。

甲壳素（chitin）由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键缩合而成，又名甲壳质、几丁质、壳多糖、蟹壳素和聚乙酰氨基葡萄糖等，是地球上仅次于纤维素的多糖，也是自然界中除了蛋白质外数量最大的含氮天然有机高分子化合物。

甲壳素广泛存在于虾蟹等甲壳动物以及各类昆虫的表皮和乌贼、贝类等软体动物的骨骼以及蘑菇和菌类的细胞壁中，许多水生生物的体内还有甲壳素。据估计，每年天然合成的甲壳素约有100亿吨。

甲壳素和壳聚糖有许多独特的物理、化学、生物特性，包括：阳离子聚电解质性质、多功能基反应活性、抗菌性、生物相容性、生物可降解性等，这些优良特性使其在纺织印染、重金属吸附回收、废水处理、食品和生物医药领域都有广泛的使用前景，本文重点关注其在医疗领域的应用。

一、甲壳素/壳聚糖概况
早在400年前，《本草纲目》中就有关于蟹壳粉的记载，这是关于甲壳素最早的记录。1811年，法国Henri Braconnot 教授从蘑菇中发现了甲壳素，并将其命名为Fungine。此后，科学家们用了将近100年的时间，才大概弄清楚其结构。

1.甲壳素/壳聚糖分子结构
（1）一级结构
甲壳素是由1→4 连接的2-乙酰氨基2-脱氧-β-D吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-β-D吡喃葡萄糖二元线型共聚物组成。分子结构如图所示：

图表1 甲壳素的分子结构

甲壳素和纤维素的分子结构比较相似，甲壳素分子通过分子内氢键和分子间氢键来维持与纤维素类似的结构稳定性，二者结晶的结构也很类似。甲壳素可以在一定程度上脱乙酰化，其脱乙酰产物为壳聚糖。

图表2 甲壳素脱乙酰化成为壳聚糖

来源：《甲壳素/壳聚糖材料及应用》


甲壳素分子可以看做是纤维素分子C2位羟基被乙酰氨基取代后得到的分子，天然甲壳素中有羟基、氨基和乙酰氨基。

氨基属于基本碱基，氨基的存在是甲壳素/壳聚糖成为迄今为止自然界中发现的唯一带阳离子碱性多糖。甲壳素分子经过脱乙酰化，得到的壳聚糖分子链的糖残基上含有氨基，因此具有更高的反应活性。氨基的存在为许多化学反应提供了可能，如乙酰化、季铵化、烷基化、接枝反应和金属螯合反应。这些反应得到的衍生物具有更好的理化性质，同时抑菌、抗病毒、防酸、防过敏等性能大大提升。

壳聚糖分子中的氨基和乙酰氨基的序列是影响其物理性质的重要参数，壳聚糖氨基使其电荷状态极易受到体系pH值的影响。pH值较低时，氨基质子化而带正电，使壳聚糖转变为水溶性的阳离子多糖，黏度减小；当pH值大于6时，氨基去质子化，使壳聚糖大分子失去电荷，不溶于水，黏度变大。

甲壳素和壳聚糖的羟基分为两种，一直是C6-OH，一种是C3-OH，前者是一级羟基，空间位阻小，反应活性强；后者是二级羟基，空间位阻大，反应活性低。羟基的存在，使甲壳素和壳聚糖能够进行醚化、酯化、接枝反应等化学反应。

（2）二级结构
甲壳素的基本性能主要由构造和构型决定。甲壳素、壳聚糖和纤维素分子外形十分相似，同为β苷键和椅氏构象，但是由于不同的分子内氢键使他们的链刚性存在差异。根据分子内氢键数的多少，链刚性从大到小依次为甲壳素、壳聚糖、纤维素。

纤维素只有两种可以形成氢键的基团，只有一类氢键；壳聚糖有3种基团，能形成分子内和分子间2种氢键；甲壳素有4种可以形成氢键的基团，能形成的氢键类型多达4种。

图表3  甲壳素分子内氢键

氢键在维持蛋白质的二级结构稳定性中发挥着重要的作用，甲壳素和壳聚糖链也是通过分子内和分子间氢键形成稳定的结构。分子内氢键保持了甲壳素链的双螺旋形。甲壳素具有复杂的螺旋结构，其基本结构单元为二糖，一个螺旋平面由6个糖单元组成。

图表4 甲壳素的螺旋结构

壳聚糖比甲壳素具有更高的构象多样性，在酸性介质中他的结构化程度降低，在高pH条件下，双螺旋占主导地位，接下来是5倍螺旋和松弛的双螺旋构象。

（3）三级结构
甲壳素的三级机构又称聚集态，包括晶态和取向，聚集态结构是决定其本体性质的主要因素，直接影响材料或制品的加工工艺和使用性能。这里我们主要讨论晶态。

晶态即结晶状态，结晶状态不同，物理化学性质也不同。目前普遍认为，甲壳素有两种结晶多型异构体，为α-型与β-型：α-型主要存在节肢动物的角质层和某些真菌中，结晶程度最高，分子间作用力也最强。β-甲壳素分子链是平行链堆积结构，与胶原蛋白结合，表现出一定的硬度、柔韧性与流动性，可以从海洋鱼类如鱿鱼的软骨中得到。

（4）分子量、脱乙酰度和结晶度
分子量、脱乙酰度和结晶度是甲壳素/壳聚糖化学结构中最重要的参数，一般来说，甲壳素/壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、分子量和黏度有关。对壳聚糖而言，脱乙酰度越高，相对分子量越小，越溶于水，相对分子量越大，黏度越大。

分子量直接影响甲壳素/壳聚糖的物理、化学和生物性质。因此在应用研究过程中，主要通过改变分子量和脱乙酰程度来研究其功能性质的变化，筛选最佳分子量和脱乙酰度。

结晶度用来表示聚合物结晶区域所占比例，变化范围很广，一般为30%-85%，对研究液态和凝胶态的甲壳素/壳聚糖而言，分子量和脱乙酰度是最重要的结构参数，而在研究固体甲壳素/壳聚糖时，考虑更多的是结晶度。

2.壳聚糖的性质
（1）物理性质
壳聚糖外观呈白色或者淡黄色半透明，多为片状或者粉末状固体，无味、无臭、无毒性，略有珍珠光泽；可溶于稀有机酸和部分无机酸，不溶于稀硫酸、稀硝酸、稀磷酸和草酸等。在酸性条件下，壳聚糖氨基质子化后可溶于水，且带正电荷，具有凝胶性和成模性。

（2）化学性质
阳离子聚电解质性质
壳聚糖是一种聚电解质，在酸性溶液中，其主链上的氨基结合质子，壳聚糖分子链在溶液中以聚电解质的形式存在，与带负电的阴离子和聚阴离子发生相互作用形成复合物。壳聚糖可以和许多合成或天然高分子之间形成聚电解质复合物，如聚丙烯酸、黄原胶、果胶、肝素、透明质酸、硫酸软骨素等。

金属螯合性
甲壳素和壳聚糖分子中有-OH、-NH-，在一定pH值条件下，使他们对一定离子半径的金属离子具有螯合作用。壳聚糖的螯合性主要应用于吸附金属离子，它对于重金属离子有很强的去除能力。

多功能反应性
壳聚糖分子链上面有羟基、氨基等活泼集团，能够发生多种化学反应，通过化学方法引进基团和侧链，以改变原有的化学和生物学性质，得到功能性增强的材料。

（3）生物学性质
生物相容性
壳聚糖是来自于自然界的天然高分子，具有良好的生物相容性。壳聚糖与人体细胞有良好的亲和性，无排斥反应，生物相容性好。

抗菌性
壳聚糖良好的抗菌性是其重要的生物性能之一。研究表明，壳聚糖对多种细菌、真菌，尤其是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果。壳聚糖的抗菌性受其相对分子量、脱乙酰基度、pH 值影响显著。

对于壳聚糖的抗菌机理，普遍认为是由于壳聚糖的阳离子特性，与细菌细胞表面带正电的成分（如，氨基酸、蛋白质、磷脂质等等）相互作用，破坏细胞表面。

止血性
壳聚糖的凝血机理主要有两个，其一是壳聚糖是自然界中唯一含有氨基的阳离子多糖, 壳聚糖中的氨基易与质子结合，呈现正电性。红细胞表面存在的各种蛋白质类物质及糖脂类物质使得膜表面带净负电荷。通过这些正电荷的作用与带负电荷的红细胞表面物质发生粘附聚集，从而快速形成血凝块进行止血。

另一方面，壳聚糖作为大分子物质在血液中发生某种聚合反应后，形成了立体网状结构，该结构通过捕获红细胞而使其聚集，形成血凝块。由止血机理可知，壳聚糖的止血效果与其脱乙酰基度和相对分子量密切相关。有研究认为，相对分子量高而脱乙酰基度较低的壳聚糖具有跟好的止血效果。

可降解性
壳聚糖是一种生物可降解的天然多糖，其结构与细菌细胞壁上的肽聚糖类似，可被体内的溶菌酶及水解酶等降解成葡萄糖胺或壳寡糖。壳聚糖体内降解速度与其脱乙酰度（DD）、相对分子量（Mw）、来源等紧密相关。溶菌酶对壳聚糖的催化水解速度随着DD的升高而降低，完全脱乙酰化的壳聚糖则不能在体内降解。

二、壳聚糖的制备
虾壳、蟹壳是工业生产壳聚糖的主要原料。由于大分子间的氢键作用，天然存在的甲壳素构造坚固，化学性质稳定，不溶于水、酸碱和一般的有机溶剂，这也使得甲壳素的应用范围非常有限，因此甲壳素只有经脱乙酰基处理成壳聚糖才能获得广泛应用。

1.化学降解法
化学降解法即利用化学试剂与甲壳素反应，使甲壳素中的乙酰基脱去生成脱乙酰基甲壳素，壳聚糖使用酸、碱均可以使甲壳素中的乙酰基脱去。由于甲壳素的葡萄糖单元之间是由苷键相连，在强酸条件下其容易水解，所以一般采用强碱来脱乙酰基。作为壳聚糖工业生产最常用的制备方法，化学降解法简便易行，效率高，整个生产过程容易控制，但该法环境污染较为严重，对周边环境具有一定的破坏性。

2.酶降解法
甲壳素脱乙酰酶是一种能催化脱去甲壳素分子中N-乙酰葡糖胺链上的乙酰基，使之变成壳聚糖的酶。该方法不但可以代替常规的浓碱热解法，解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，生产出高质量的壳聚糖，还可以生产出某些用化学法不能生产的壳聚糖制品。因此该酶具有巨大的工业应用潜在价值，当前国内外对于甲壳素脱乙酰酶都有诸多研究。

与上述提到的其他方法相比，利用甲壳素脱乙酰酶制备壳聚糖可实现少用甚至不用氢氧化钠（浓碱），其温和的催化反应条件，不仅节约能源，而且对环境保护具有重要意义。但目前优良产酶菌的选育、提取和培养等严重制约了这一方法的推广。

3.微生物培养法
微生物发酵法生产壳聚糖起源于美国，我国从上世纪90年代开始研究。其主要原理是利用微生物自身生产的酶进行催化，从而脱去甲壳素中的乙酰基，进而制备壳聚糖。目前该领域研究重点主要集中在优良菌株的选育和培养基的优化上。

4.微波技术
微波是一种电磁波，在化学反应中，通常采用2450MHz的微波进行辐射处理。在壳聚糖的生产中，采用微波辐射降解具有操作简便、反应时间短、能源使用率高等优点，但由于微波使升温过快也会产生甲壳素降解反应不充分等弊端。

三、壳聚糖材料的不同形态与功能
1.纤维
以壳聚糖为原料通过湿法纺丝制备的壳聚糖纤维具有优良的生物相容性、生物可降解性、亲水性等特性，且其独特的化学结构赋予纤维一系列优良使用功效。壳聚糖纤维可通过纺纱、机织、针织、非织造等工艺制备医用纺织材料：以壳聚糖纤维为原料制备的手术缝合线具有生物可降解特性，可通过控制脱乙酰度调节其降解速度，壳聚糖纤维的机织和针织物是多孔结构支架材料，可用于细胞移植和组织再生，壳聚糖针刺非织造布可用于伤口护理，壳聚糖水刺非织造布在功能性美容化妆品领域具有独特的应用价值。

2.制膜
壳聚糖具有优良的成膜性，制备的膜材料有良好的生物相容性、生物降解性以及透气性能，同时由于分子链上存在大量的羟基，使其具有良好的亲水性。壳聚糖可以制备成食物保鲜膜、超滤膜、渗透膜、离子交换膜以及药物释放膜等。

3.水凝胶
高分子水凝胶是能够保持大量水分，又不能被所含液体溶解的一些高分子聚合物统称，通常高分子为交联状态。亲水性高分子水凝胶具有三维网状结构，显示出良好的物理化学性质和生物学性质，在药物可控释放、生物黏附和生物可降解材料方面有重要的应用前景。

壳聚糖酸性水溶液有一定黏度，遇到碱性环境会立即变成凝胶，但是这种凝胶受环境pH值影响比较大，强度不高。制备壳聚糖水凝胶的方法有物理交联法、化学交联法和辐射交联法。

4.微球
在高分子微球功能应用方面，壳聚糖因为有良好的生物相容性、无毒性、生物黏附性、生物降解性及良好的成膜性而成为有广阔前景的高分子微球。常用的制备方法有溶剂蒸发、喷雾干燥、离子凝胶法等，制备以后常常需要教练来提高壳聚糖微球在酸中的稳定性。

近年来， 微孔膜乳化技术在大量制备单分散性微球方面有独特优势，制备能耗低、条件温和且利于药物活性的保持和大规模制备。微球用途广泛，在生化工程和医药工程中有着重要的作用。

5.纳米粒
纳米粒是指粒度在1-100nm之间的粒子，纳米粒子表明活化中心多，比表面积大，在医学和生物工程上有许多应用。壳聚糖纳米化，不仅可以改善其溶解性，还可以提高物理、化学和生物学特性，如增加药物的吸收作用、增强药物靶向性和降低药物副作用、提高药物稳定性、增强药物缓释作用等等。

壳聚糖纳米粒子合成的方法有共价交联法、离子交联法、去溶剂化法、大分子复合法和自组装法等。

四、壳聚糖的应用-医疗器械
目前壳聚糖在医疗领域应用比较多的方向为医疗器械。我国从20世纪90年代初开始广泛研发壳聚糖类医疗器械产品。截至目前共可查询到220个已在中国注册的产品（包括既往注册的），其中国产产品217个，进口产品3个。

图表5  进口的壳聚糖医疗器械产品

产品的作用原理包括：
抗菌/抑菌
壳聚糖及其衍生物有良好的抗菌活性，能抑制某些真菌、细菌和病毒的生长繁殖。可能原理包括多聚阳离子的结合作用、干扰DNA的复制与转录以及阻断原菌代谢。

凝血
壳聚糖本身可以吸附血小板，由血小板激活凝血。壳聚糖的乙酸水溶液使红细胞凝聚和变形，从而使血液凝固。

防粘连
壳聚糖不溶于水，经过醚化制成羧甲基壳聚糖后溶于水。羧甲基壳聚糖置入体内后短时间与体液相互作用，溶解形成一层膜状结构，附着于组织器官之间避免相互接触达到隔离作用。缓慢降解后最终降解物为氨基葡萄糖单体，被机体吸收。

目前，我国在用的壳聚糖品种，按用途可以分为防粘连隔离膜、促伤口愈合产品、治疗皮肤病产品、口腔用械、妇科用械等。

图表6  不同用途的壳聚糖医疗器械产品

按照壳聚糖医疗器械产品的不同理化特性和形态，可以分为液体、水性凝胶、海绵体，粉末以及无纺布等。

图表7  不同形态的壳聚糖医疗器械产品

按照管理类别，分为第一、二、三类器械。
第一类：多为含壳聚糖成分的创口贴，贴于皮肤表面；
第二类：多为促进伤口愈合的敷贴及敷料类产品，用于体表；
第三类：包括医用可降解术后防粘连壳聚糖产品、壳聚糖可吸收止血纱布、医用防粘连改性壳聚糖等。该类产品具有防粘连作用，置入体内后形成膜状结构依附于组织器官，达到生物隔离的作用，预防因手术引起的有害粘连。

图表8  中国上市的三类壳聚糖医疗器械

此外，壳聚糖支架在组织工程、骨科、神经外科等都有比较好的应用，目前尚处于早期的研究中。

五、壳聚糖的应用-药物
壳聚糖在医药方面的应用目前还处于早期演进阶段，主要的研究方向包括两个方面，一是壳聚糖作为药物载体；二是壳聚糖在免疫应答中的作用。

1.壳聚糖作为药物载体
抗肿瘤药物靶向载体
壳聚糖纳米粒( chitosan nanoparticles, CS-NPs) 作为药物载体具有粒径小、无毒和增加药物溶解度的优势，结合实体瘤部位的高通透性和滞留(EPR)效应可使药物被动靶向于癌变部位,提高药物疗效。CS-NPs作为被动靶向药物载体，对全身系统性肿瘤可显著提高药物的治疗效果，但对于某些特异性局部肿瘤,则需要可以靶向于肿瘤细胞膜、细胞质或细胞核的主动靶向制剂。当CS被特异性靶向分子修饰后，便可通过抗原-抗体或配体-受体结合的方式，提高药物在靶细胞中的浓度,从而提高药物疗效、降低药物对正常组织的损伤。

缓控释药物载体
对于自身带有负电荷的药物，选用壳聚糖纳米粒作为药物载体可以达到缓释、控释释药的目的。多阴离子的药物与带正电荷的CS之间会发生强烈的电荷作用，形成交联聚合物，这种交联聚合物具有较为稳定的结构，延长了药物从其中释放的周期，以达到缓释、控释释药的目的。

在基因载体中的应用
CS是一种优良的基因载体,因为CS基本结构单元中存在大量游离的带有正电荷的氨基,而基因中的磷酸基团带有负电荷,两者可以通过电荷作用结合在一起形成聚合物。基因与CS通过电荷作用形成的纳米级复合物,不仅可以防止基因被降解和被体循环清除,还可以促进基因透过细胞核膜,提高细胞对基因的摄取。

2.壳聚糖在免疫应答中的作用
免疫是人体为维护自身健康所具备的一种能够抵御外侵的抗原物质以及排斥并杀伤自身所产生的损害细胞的自体功能。机体内免疫分两种应答类型，一种是与生俱来的非特异性免疫，也叫固有免疫，包括皮肤和粘膜结构以及体液中的杀菌物质和吞噬细胞等，对多种病原体都能产生免疫杀伤作用，无针对性；另一种是具有针对性的特异性免疫，其免疫应答包含细胞免疫和体液免疫。壳聚糖不仅能对固有免疫起作用，同时也可对特异性免疫起作用。

固有免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，没有特异的选择性，其作用范围广，反应出现快，参与的免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞）较多。Kosaka等对狗进行皮下埋植壳聚糖实验，结果发现壳聚糖组在埋植后4d内，血液中白细胞尤其是嗜中性粒细胞的数量增加；而5d后，对照组巨噬细胞活性显著减少，壳聚糖组仍保持较高的巨噬细胞活性。藻酸盐与壳聚糖作为免疫增强剂的联合给药能使适应性和先天性免疫应答反应均有显著的增强效果，并持续至免疫后的第6周；同时，壳聚糖还能调节体内pH来增强自然杀伤细胞（NK细胞）活性及增加机体内抗体的生成。

免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）是免疫应答反应中重要的免疫球蛋白，Sun等通过喂食壳聚糖的方式对奶牛进行特异性免疫实验，经检测发现：奶牛血液中的T淋巴细胞活性和血清中IgG、IgM浓度均有明显提高。同样，魏涛等用不同剂量的壳聚糖喂食昆明小鼠，结果证明壳聚糖不仅能促进巨噬细胞的吞噬，还可通过正负电性结合，激活T淋巴细胞，分泌信号因子促使B细胞产IgG、IgA等免疫球蛋白，进而增强机体的细胞免疫应答和体液免疫应答。

壳聚糖不但可直接调节免疫应答反应，还可由其静电结合特性，实现对蛋白质或DNA等分子的靶向运输；再加上其具有良好的生物相容性、生物安全性等特点而被广泛用作免疫佐剂。

六、结语
壳聚糖来源广泛，具有独特的化学结构、良好的生物相容性、可降解、生物安全性以及低毒性，被广泛的应用于各个领域。壳聚糖的全球销售额从2014年的4292吨增加到2018年的5216吨，复合年增长率为5％。2018年，全球壳聚糖收入从2014年的6622万美元增至8201万美元。

目前壳聚糖在抑菌、止血、手术防粘连等领域应用已经比较成熟，在组织工程、药物载体、免疫应答、疫苗佐剂方面的应用还处于试验研究的阶段，但是其应用前景的广阔毋庸置疑。



参考资料：
1.《甲壳素/壳聚糖材料及应用》，施晓文、邓红兵、杜予民著，化学工业出版社，2015年
2.《壳聚糖与疫苗的黏膜递呈》，李宇红，国外口腔医学分册2004年9月第31卷第5期
3.《食品药品监管总局办公厅关于通报壳聚糖类医疗器械产品再评价情况的函》，食药监办械监函【2016】455号，2016年6月15日
4.《壳聚糖医用敷料研究进展》，杨玲玲、丁雪佳、王国胜、刘艳红，透析与人工器官，2017年12月（第28卷）第4期
5.《壳聚糖的制备方法及研究进展》。张立英，山东工业技术。
6.《壳聚糖的特性分析及其免疫调节功能研究进展》，张沛、姚朝增、韩锰、周苗苗、周源、杨艳，药物分析杂志2019,39(10)
7.《壳聚糖及其衍生物在药物载体中的应用》，王海荣、纪宏宇、冯佳玉、张诚诚、吴琳华，中国药师2018年第21卷第2期
8.《壳聚糖及其衍生物在神经外科中的应用进展》，苏迪娅、万虹，中华神经外科杂志，2014年10月第30卷第10期
9.《壳聚糖构建细胞支架的研究现状》，孙铁锋、王平、高志惠，药学研究2015Vol.34，No.4

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